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一项比较研究,以确定肠道微生物组与中国浙江精神分裂症的关系

摘要

背景

随着高通量测序技术的快速发展,对精神分裂症(SZ)的表征与潜在肠道微生物组的探测可以探索致病机制,估计疾病风险,并允许定制治疗和预防方式。在这项研究中,我们通过靶向下一代测序(16S rRNA扩增子)比较了中国浙江50名SZ受试者和50名健康匹配受试者肠道微生物多样性和组成的差异。

结果

相应地,健康对照组肠道微生物群的α多样性指数(观察物种指数、Shannon指数和Simpson指数)均高于SZ组。此外,主坐标分析和beta多样性的非度量多维标度显示,SZ患者比健康对照组聚集得更紧密。在门水平上,我们发现拟杆菌门而且变形菌门SZ组显著升高。在属水平上,的相对丰度普氏菌Parabacteroides,Sutterella的丰度明显更高,而FaecalibacteriumBlautia毛螺菌属梭状芽胞杆菌瘤胃球菌属,Coprococcus均低于健康对照组。进一步的分析显示琥珀酸弧菌属Megasphaera,Nesterenkonia可作为区分SZ患者与对照组患者的潜在生物标志物。

结论

这项研究分析了SZ和健康人群之间肠道微生物群多样性、分类组成和功能的差异,这项研究的见解可用于开发针对SZ的有针对性的下一代基于测序的诊断。

同行评审报告

简介

人类肠道微生物群是一个复杂的生态系统,由100万亿个微生物(细菌物种、真菌和病毒)组成,携带超过300万个基因(肠道微生物组),可以影响人类的生理、行为和健康[12].它随着时间的推移而变化,这取决于宿主的遗传易感性、年龄、行为、饮食习惯、抗生素使用和生活环境。位于人体胃肠道中的微生物具有多种功能,包括吸收营养物质和矿物质,建设性合成短链脂肪酸(SCFAs)和维生素,以及产生微生物代谢产物。越来越多的证据表明,人类肠道微生物群落的差异会导致各种疾病,如肝病、糖尿病、炎症性肠病、多发性硬化症、大肠癌和神经精神障碍[3.45678].此外,少数研究揭示了与这些疾病直接或间接相关的微生物基因或代谢途径的预测或实际功能改变。因此,了解人与微生物群相互作用中涉及的通信或信号通路对于研究致病机制、估计疾病风险、允许定制治疗方式、监测治疗进展和制定预防策略至关重要。

由于大多数肠道微生物难以培养,具有高通量、读长、灵敏度、特异性、精密度和准确性的下一代测序(NGS)平台已被广泛应用于微生物组成的表征。为提高微生物鉴定的敏感性,克服微生物序列扩增水平低的困境,对目标和感兴趣序列进行富集过程(16S rRNA, 18S rRNA, 23S rRNA [9]和内部转录间隔段)可以通过聚合酶链式反应(PCR)进行,然后进行高通量测序[9101112].尽管定向下一代测序(tNGS)只能直接表征细菌分类,但它是一种具有成本效益的选择,可以通过最小测序全面覆盖许多样品的生物多样性(测量相对丰度的最大动态范围)。在过去的十年中,这种强大的替代方法极大地促进了各种新的发现,帮助我们调查和描述来自人类肠道、土壤和海洋的肠道微生物群[131415].更重要的是,生物信息学分析可能最适合于探索预测或实际的微生物功能和代谢途径。

精神分裂症(SZ)是一种严重的精神疾病,其全球终生患病率为0.4%,遗传率约为0.81(置信区间0.73-0.90)[1617].明显的症状主要分为五个领域:幻觉、妄想、思维(言语)混乱、严重混乱和异常的人类行为。虽然SZ的生理现象尚未被探索或解释,但被诊断为SZ的患者通常以精神病症状、社会功能差和生活质量差为特征。对于SZ患者的分子诊断,越来越多的NGS证据表明,与健康匹配对照相比,SZ患者广泛观察到人类肠道微生物多样性和分类组成的改变,这极大地促进了生物标志物的发展[181920.].然而,我们正在完全区分正常的微生物群与深圳的微生物群,或者认识到其大量的代谢途径如何对健康起作用。此外,肠道菌群与中枢神经系统之间通过肠-脑轴存在着密集而广泛的双向信号传递[21].这一过程与神经元、内分泌和免疫机制密切相关,这些机制允许肠道菌群影响各种人类精神状态和稳态。因此,有必要破译肠道菌群的内容、多样性和功能,以评估SZ患者的治疗机会和策略。

在这项研究中,我们重点研究和描述了SZ患者与健康人之间肠道微生物多样性和分类组成的差异。此外,我们预测了肠道微生物群的遗传潜力,并阐明了功能差异如何影响人体肠道内的生理过程。我们的目标是全面了解SZ人类肠道菌群的预测或实际致病机制,特别强调基于微生物的诊断生物标志物的潜力。

材料与方法

研究总体和样本收集

简单地说,100名年龄在20到58岁之间的男性参与了这项研究。从浙江省丽水市第二人民医院招募50例SZ患者,从同省招募50例健康匹配者(NC组)。根据世界卫生组织《疾病和相关健康问题国际统计分类第十版》(ICD-10),根据妄想、思维紊乱、幻觉、注意力受损、丧失动力、情感表达迟钝和怪异行为等症状对SZ进行诊断。症状必须出现至少一个月,并排除其他健康状况和使用物质或药物引起的表现。只有精神分裂症的严重程度符合ICD-10标准的患者才被选择。此外,在样本采集前3个月内,抗精神病药物的剂量稳定。所有没有遗传疾病的合格受试者都保持有规律的饮食和有氧运动,并拒绝服用抗生素。在研究开始前,所有符合条件的参与者及其监护人都收到了关于研究的完整解释,并提供了书面知情同意书。

为SZ和NC受试者提供粪便收集管(Simgen,杭州,中国),并提供详细的制造商收集新鲜粪便样本的方案。所有样品保存在-80°C。

DNA提取和测序

在DNA提取之前,根据16S rRNA地球微生物组协议(earthmicrobiome.org)对样品进行预处理。然后,根据制造商的说明,使用Omega Bio-tek粪便DNA试剂盒(Omega Bio-tek, Doraville, CA, USA)从样品中提取gDNA。额外的阳性和阴性DNA对照包括在内,以便根据读取计数计算样本排除。之后,使用琼脂糖凝胶电泳和PicoGreen法(赛默飞世尔科学公司,克利夫兰,OH,美国)评估DNA的质量。最后,测序前将DNA保存在−20°C。

首先,使用Oligo软件(v7.0)设计341f (5 ' -CCTAYGGGRBGCASCAG-3 ')和806r (5 ' -GGACTACNNGGGTATCTAAT-3 ')条形码引物[22],使用Primer-BLAST验证(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/),由生工生物技术(中国上海)公司合成。其次,根据之前工作中描述的方法,通过PCR生成16 s扩增子[23].在使用agcourt AMPure XP PCR纯化试剂盒(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)清洗之前,使用琼脂糖凝胶电泳和PicoGreen法评估扩增子的质量。扩增文库扩增使用Nextera XT DNA Sample Prep (Illumina, San Diego, CA, USA)。然后,用AMPure珠清洗扩增子库一次,并用量子比特荧光计(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)测量DNA浓度。配对端测序在MiSeq平台(Illumina, San Diego, CA, USA)上进行,使用MiSeq Reagent Kit v3 (Illumina, San Diego, CA, USA),每端产生300 bp的reads。原始测序文件上传并使用MiSeq Reporter (Illumina, San Diego, CA, USA)进行进一步分析。

生物信息数据处理

使用FastQC v0.11.3对原始测序数据质量进行评估(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc).为了生成高质量的测序数据,使用Trimmomatic v0.36排除了低质量的读取和Illumina适配器[24].使用默认设置的FLASH v1.2.11合并和组装成对的读取[25].操作分类单元(OTUs)定义为与Greengenes数据库相似度至少85%的序列,使用UClust聚类算法(http://drive5.com/usearch/)采用QIIME v1.9.1中的紧密参考方法[2627].扩增子序列变体(ASVs)使用分裂扩增子去噪算法2 [28].对ASV代表序列进行分类分配,置信阈值为0.8-1.0,使用预先训练的朴素贝叶斯分类器,该分类器在核糖体数据库项目分类器v11.5上进行训练[29].采用R包v4.0.2中的纯素函数进行主成分分析(PCA)排序。

为了同时考虑物种的丰度和均匀度,alpha多样性分析,包括观察物种指数、香农多样性指数[30.]和辛普森多样性指数[31]使用QIIME v1.9.1进行[27].Beta多样性采用Bray-Curtis不相似度计算[32]和UniFrac [3233].为了可视化样本之间的相似性,使用主坐标分析(PCoA)对输出矩阵进行排序,并使用EMPeror [34].使用R包v4.0.2(纯素)基于总beta多样性计算每个样本的非度量多维尺度(NMDS)。相似性分析(ANOSIM)和指标值分析分别采用R包v4.0.2 (vegan和labdsv)进行。使用Venn程序v1.6.16生成了说明所有样品共同属的Venn图。对于功能社区分析,Tax4Fun使用QIIME v1.9.1和SILVA数据库扩展进行评估[2735].关键是将16S rRNA基因测序数据与KEGG数据库进行比较,实现功能注释[36].

统计分析

分别采用连续变量和离散变量的Student 's t检验和卡方检验总结和分析参与者的人口学特征和临床特征。群体显著性(韦尔奇t检验)和因果进行分析(错误发现率和Bonferroni校正),以确定健康种植体周围部位和种植体周围炎患者之间存在丰度差异的asv。使用R软件v4.0.2进行统计和绘图。以0.05为差异有统计学意义。

结果

采样信息

根据纳入和排除标准,我们招募了50名SZ男性患者和50名健康男性个体。两组患者的人口学和临床特征见表1.年龄方面无显著差异(p= 0.1311),权重(p= 0.1811),身体质量指数(BMI,p= 0.4817)。但NC组身高显著高于SZ组(p= 0.0460)。在BMI分类方面,瘦(BMI < 18.5,p= 0.0412)和肥胖(BMI≥28,p= 0.0412)组。最后,SZ患者抗精神病药物的使用分布主要为利培酮(28%)、氯氮平(20%)、奥氮平(40%)、喹硫平(24%),其中26%的患者在临床治疗期间同时服用了两种抗精神病药物。

表1参与者的人口学特征和临床特征

微生物多样性

健康对照组共获得8,911,266个reads(1,869,170,520个碱基),而SZ受试者的50个微生物组样本包括5,816,276个reads(1,320,847,922个碱基)。经过质量筛选、适配器还原和配对读集组装,我们在健康对照组中获得了4376659个原始标签、4321,992个有效标签和21,507个OTUs,每个样本分别为23,459 - 414,271、23,392 - 409,960和115 - 844。此外,SZ组有2,667,140个原始标签,2,645,060个有效标签和12,230个OTUs,每个样本分别为19,503至68,895,19,387至677,766和101至516。稀度曲线(图S1A)和秩丰度曲线(图S1B)证实了高通量测序数据的有效性,并揭示了微生物群落的丰度随个体样本的不同而不同。

为了表征微生物群落的丰富度和多样性,我们计算了每个样品的alpha指数。SZ组和NC组观察到的物种指数有显著变化(图2)。1一个,p= 6.88e-07), Shannon指数(图;1B,p= 5.94e-05), Simpson指数(图;1C,p= 6.85e-04)的alpha多样性。相反,基于otu的beta多样性是样品之间微生物群落组成的比较分析。我们观察到PCoA(图。2A)和基于nmds的映射(图;2B, stress = 0.093)未加权UniFrac指标显示,当NC受试者形成不同的聚类时,SZ受试者紧密聚类(组内距离比较)。此外,部分NC聚类与SZ组的聚类接近。此外,ANOSIM分析(图。2C)表明微生物群落结构存在显著差异(UniFrac, unweighted UniFrac,R= 0.152,p= 0.001)。

图1
图1

alpha多样性指数(一个:观察物种指数,B:香农指数,C: Simpson指数)对SZ组和NC组肠道菌群OTUs的影响

图2
图2

UniFrac非加权PCoA (一个)和二维NMDS (B)比较两组间样本分布的图。C16s rRNA基因UniFrac ANOSIM无加权检测。用峰高作为丰度的衡量来比较样本。“Control”为NC组。Case表示SZ组

分类组成的差异

为了更好地理解OTU信息和分类注释,对标签和OTU进行了计算和汇总。如图所示。3.A, NC组的优势菌为厚壁菌门(57.43%),拟杆菌门(33.08%),变形菌门(4.55%),放线菌(2.31%)和Fusobacteria(1.83%),而SZ队列以厚壁菌门(42.93%),拟杆菌门(42.03%),变形菌门(9.04%),Fusobacteria(2.55%)和放线菌(1.72%)。当比较细菌门的相对丰度(图S2一个),拟杆菌门p= 4.11e-03)和变形菌门p= 0.0371)均在SZ组高于NC组。在这方面厚壁菌门水平,SZ组显著降低(p= 3.98e-05)。在属水平(图。3.B), NC组主要分配给拟杆菌(24.26%),Faecalibacterium(12.59%),Roseburia(6.89%),普氏菌(4.43%),Megamonas(3.31%),Blautia(3.13%),毛螺菌属(2.58%),梭状芽胞杆菌(2.30%),瘤胃球菌属(1.99%)和Coprococcus(1.81%)。SZ类群中丰度最高的属为拟杆菌(25.66%),其次是普氏菌(10.24%),Faecalibacterium(7.95%),Roseburia(4.93%),琥珀酸弧菌属(3.68%),Megamonas(2.96%),Parabacteroides(2.49%),Dialister(2.00%),Sutterella(1.67%)和梭状芽胞杆菌(1.33%)。与健康人群相比(图S2B),的相对丰度普氏菌p= 0.0157),Parabacteroidesp= 0.0342),和Sutterellap= 0.0365)显著高于SZ队列。然而,Faecalibacteriump= 4.25 e 03),Blautiap= 3.04 e-05),毛螺菌属p= 6.36 e 03),梭状芽胞杆菌p= 0.0287),瘤胃球菌属p= 0.0380),和Coprococcusp= 0.0258)的水平在健康队列中较高。

图3
图3

门级微生物组成(一个)和属级(B).“Control”为NC组。Case表示SZ组

维恩图说明了共有属和特定属的分布,以识别候选微生物生物标志物。如图所示。4A和4B,所有个体,无论SZ患者和健康人,均具有一致检测到的总成员中的73个共同属。此外,我们还计算了指标值,以确定微生物诊断的候选生物标志物。琥珀酸弧菌属p= 0.001),Megasphaerap= 0.001),和Nesterenkoniap= 0.005)在SZ组更丰富,而Blautiap= 0.001),副球菌p= 0.001),Adlercreutziap= 0.001),Enhydrobacterp= 0.001),Eggerthellap= 0.002),棒状杆菌属p= 0.002),Oxalobacterp= 0.002),和Finegoldiap= 0.005)。4C)。

图4
图4

一个共有属和特异属的维恩图。B扰动的维恩图。C特定属的指标值。“Control”为NC组。Case表示SZ组

微生物群的功能差异

通过Tax4Fun分析揭示和探讨SZ组和NC组肠道微生物组功能的差异。如图所示。5、萜类化合物/多酮类化合物的代谢(p= 4.37e-07),排泄系统(p= 9.50e-05),能量代谢(p= 2.08e-04)、癌症(p= 3.93e-04),循环系统(p= 2.87e-03),神经系统(p= 4.44e-03),信号转导(p= 5.49e-03),以及异种生物降解/代谢(p= 0.0220), SZ组较NC组有上升趋势。然而,转录显著降低(p= 1.33e-03),核苷酸代谢(p= 2.10e-03)、免疫疾病(p= 3.42e-03),复制/修复(p= 5.46e-03),膜转运(p= 0.0131),平移(p= 0.0139)。接下来,我们分析了变异属的相对丰度与差异功能通路之间的相关性。Faecalibacterium瘤胃球菌属CoprococcusAdlercreutziaBlautia,副球菌与核苷酸代谢、转录、复制/修复和翻译呈正相关(图。6).与此同时,Parabacteroides与萜类/多酮类代谢、神经系统、排泄系统、循环系统何时呈正相关普氏菌对癌症有积极作用。相比之下,Coprococcus棒状杆菌属,Adlercreutzia与信号转导、神经系统和循环系统呈负相关。此外,Blautia与能量代谢和癌症呈负相关。

图5
图5

显著差异(PSZ组(病例组)和NC组(对照组)肠道菌群KEGG通路均< 0.05)。柱状表示功能通路的平均相对丰度,两组间有显著差异,置信区间分布为95%p值显示在他们的右边

图6
图6

不同属的相对丰度与差异相对丰度代谢途径之间的相关性热图。颜色表示Pearson相关系数

讨论

在我们的研究中,使用16S rRNA基因V3和V4区域的tNGS进行生物信息学分析,评估来自中国浙江的SZ患者和健康对照受试者肠道中的微生物多样性和组成。我们的第一个主要发现是SZ组和NC组之间人类肠道的微生物多样性发生了改变。NC组肠道微生物群落的α多样性指数(观察物种指数、Shannon指数和Simpson指数)高于SZ组,说明健康受试者肠道微生物群落的丰富度和多样性更高。典型的观察结果是,SZ患者精神病人群的α -多样性得分下降[3738].一般来说,alpha多样性指数高被认为是健康状态的标志。综上所述,较低的α多样性表明患者体内整体微生物生态异常,并与一系列人类慢性疾病有关[39].此外,beta多样性指标被考虑使用非系统发育方法。由此产生的beta多样性表明,当NC受试者的集群在PCoA和NMDS空间中更广泛地分布时,SZ患者紧密地聚集在一起。因此,我们对OTU进行了定义和分类注释,以便进一步分析。

重点分析了肠道菌群在门和属水平上的群落结构。不论年龄、体重、身高、BMI、BMI分类,正常人和SZ患者的肠道微生物组成主要由5大门组成:厚壁菌门拟杆菌门变形菌门放线菌,Fusobacteria.这一结果与以往的研究一致[184041].然而,最重要的变化是相对丰富的拟杆菌门(属:普氏菌而且Parabacteroides),变形菌门(属:Sutterella)在SZ患者中明显高于健康对照组。相比之下,我们发现的比例厚壁菌门(属:FaecalibacteriumBlautia毛螺菌属瘤胃球菌属,Coprococcus和放线菌(属:棒状杆菌属而且Adlercreutzia)在SZ受试者中较低。越来越多的研究证实了这一点FaecalibacteriumBlautia毛螺菌属瘤胃球菌属Coprococcus棒状杆菌属,Adlercreutzia都是有益的系统型。分析并讨论了细菌丰度与功能的关系。我们的研究结果显示FaecalibacteriumBlautia瘤胃球菌属CoprococcusAdlercreutzia,副球菌调节多种分子过程,如核苷酸代谢,转录,复制/修复和翻译。众所周知,核酸合成、DNA增殖、DNA修复和RNA生产都需要核苷酸代谢来维持基因组的稳定。此外,RNA被翻译成具有正确结构的蛋白质,参与细胞周期不同阶段的细胞增殖、维持、修复和调节。

减少Coprococcus棒状杆菌属,Adlercreutzia信号转导、神经系统、循环系统均呈上升趋势。更严重的是,水平的下降Blautia导致癌症发病率上升。据报道,……的减少Blautia毛螺菌属Coprococcus棒状杆菌属,而阿德勒克氏症可能是由抗精神病药物引起的,并与SCFAs的减少密切相关[42].SCFAs能够调节多种免疫和表观遗传途径,如肠上皮细胞的屏障功能、肥胖相关炎症、巨噬细胞释放白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α、细胞因子相关核因子κ b信号通路[43]和抑制组蛋白去乙酰化酶[43444546].这些生物学途径在SZ也被检查和验证为失调。尽管SCFAs具有抗炎特性,但SCFAs在大脑中的核心作用及其与神经生物学因子和通路(包括神经递质回路、神经营养因子和其他脑代谢物)的关系在很大程度上仍然未知。

必须承认,这项研究最重要的局限性是样本量小。例如,来自同一地区的只有100名男性受试者参与了这项研究,每个人都测试了一个微生物组样本。一般来说,微生物的多样性和组成随性别、地区、时间和其他因素而波动[2347].同样,在我们的分析中,我们没有匹配肠道微生物组或吸烟流行率的控制。SZ患者明显倾向于吸烟,有研究表明,生物学因素可能是这种疾病与烟草使用之间联系的基础。此外,缺乏动物和细胞方面的机制研究。所有这些状态限制了我们在统计上探索微生物组差异的预测或实际混淆的程度,以及微生物组和功能差异之间的相关性分析的力量。因此,这些结果应该被认为是初步的。

限制

尽管我们的研究存在一些局限性,但我们仍然对SZ的监测做出了重要贡献。根据分类区系,Venn图显示有11个属可作为区分SZ的重要诊断生物标志物。为了进一步验证对预测性能有显著贡献的生物标记物,我们计算了指标值并进行了韦尔奇t检验。预测模型琥珀酸弧菌属Megasphaera,Nesterenkonia在属水平上显示出显著的辨别能力。这种微生物诊断策略是高度准确和有效的。在未来,我们可能能够通过测量基于tngs的微生物群来帮助精神科医生诊断SZ和预测疾病进展。

未来的建议

综上所述,我们证实了SZ患者与健康个体之间肠道微生物组的组成和功能存在一定的差异,本研究的见解可用于开发基于tngs的SZ诊断。在未来,微生物生物标志物很可能会成为快速和高度敏感的工具,用于SZ疾病的检测和诊断。需要进一步设计良好的试验来验证结果,并在临床环境中使用动物模型得出因果关系。

数据和材料的可用性

本研究中使用和/或分析的数据集已提交给NCBI生物项目资源库,[登录号PRJNA880407]。

缩写

体重指数:

身体质量指数

门店:

新一代测序

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

深圳:

精神分裂症

SCFAs:

短链脂肪酸

tNGS:

定向下一代测序

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下载参考

确认

感谢徐旭芳和陈依依(中国丽水第二人民医院)对数据分析的帮助。

资金

本研究由何林院士新医学临床翻译工作站科研基金资助(17332005)。

作者信息

作者及隶属关系

作者

贡献

G.J.设计了实验;F.Y, L.X, x.l和L.D.研究了总体和样本收集;F.Y.和L.X提取RNA并制备测序文库;g.j.、F.Y.和L.D.分析了数据;G.J.写了手稿。所有作者都审阅了手稿。作者阅读并批准最终的手稿。

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道德声明

伦理批准并同意参与

本研究由丽水市第二人民医院伦理委员会批准(批准号:20180705-1,批准日期:2018年7月5日)。并获得所有参与研究的受试者的知情同意。所有的方法都按照相关的指导方针和规定进行。

发表同意书

不适用

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

额外的信息

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

补充信息

附加文件1:

图S1。(A)古生菌16S rRNA基因克隆文库的稀疏曲线分析。(B)古生菌16S rRNA基因克隆文库的秩丰度曲线。示例颜色代码在图例中给出。图S2。SZ组(病例)和NC组(对照组)肠道菌群门水平(A)和属水平(B)的微生物组成和丰度。柱状图表示每个属的平均相对丰度,两组间差异显著,置信区间分布为95%p值显示在他们的右边。

权利和权限

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严,F,夏,L,徐,L。et al。一项比较研究,以确定肠道微生物组与中国浙江精神分裂症的关系。manbetx安卓app22, 731(2022)。https://doi.org/10.1186/s12888-022-04328-w

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关键字

  • 肠道微生物组
  • 16S rRNA测序
  • 精神分裂症
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